Summary Class notes - MBT

Course
- MBT
- Sigrid Beiboer
- 2017 - 2018
- Hogeschool Leiden (Hogeschool Leiden, Leiden)
- Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek
237 Flashcards & Notes
3 Students
  • This summary

  • +380.000 other summaries

  • A unique study tool

  • A rehearsal system for this summary

  • Studycoaching with videos

Remember faster, study better. Scientifically proven.

PREMIUM summaries are quality controlled, selected summaries prepared for you to help you achieve your study goals faster!

Summary - Class notes - MBT

  • 1508450400 Basisprincipes van de PCR

  • Wat is mRNA?
    Een kopie van het genomisch DNA en is de template bij eiwitsynthese.
  • Wat doet een PCR?
    vermeerdert (amplificeert) een specifiek stuk DNA
  • Wat is rRNA?
    Ribosomaal RNA vormt het RNA deel van het ribosoom, de eiwitsynthesemachine van de cel.
  • Waarom doe je een PCR?
    - aanwezigheid gen of andere sequentie aantonen
    - promotor, gen of andere genetische onderdelen kloneren
  • Wat is tRNA?
    Transfer RNA levert het juiste aminozuur aan het ribosoom bij de eiwitsynthese.
  • Waarop baseer je een PCR?
    DNA replicatie in een cel 
    - DNA polymerase beweegt over het DNA van 3 -> 5
    - DNA polymerase maakt nieuw DNA van 5-> 3
  • Wat is snRNA?
    Small nuclear RNA speelt een rol bij het splicen van mRNA.
  • Waarmee maak je een PCR specifieker?
    - primer PCR voor PCR ontwerp
    - primase RNA primer voor DNA replicatie
  • Wat is miRNA?
    Micro RNA's zijn korte stukken niet-coderende RNA die de eiwitsynthese blokkeren. (genexpressie)
  • Wat is het verschil tussen replicatie en PCR?
    1. RNA primers/ artificiële DNA primers (oligo's)
    2. 37C en 96C
    3. helicase bij replicatie, taq polymerase (72C) bij PCR
  • Wat bevat een lysisbuffer?
    Natrium-/Tris-zouten, EDTA (een detergens), proteasen (Lysozym/proteinase K) en nucleaseremmers.
  • Wat is het protocol van PCR?
    1. denaturatie ( = uitsmelten) 90-96C, 15-30 sec
    2. annealing (= hybridisatie primer) 50-65C, 15-30 sec
    3. extensie ( = elongatie door polymerase) 72C, 30s-5 min
    (4. DNA synthese 72C, 10 min)
  • Waar bevinden alle stoffen zich bij de fenol/chloroform isolatiemethode?
    Eiwitten in de interfase, nucleinezuren en koolhydraten in de waterfase (bovenste fase), organische oplosmiddelen en vetten onderin de buis.
    Na preciptatie met isopropanol is het DNA/RNA op de bodem neergeslagen.
  • Waaraan moet een primer design aan voldoen?
    • 3'end G of C
    • 17-28 bp
    • 40-60% GC
    • dimeren en interne 'self-annealing' voorkomen
    • Tm tussen 50-70C
  • DNA is stabieler als RNA en RNA wordt daarom ook sneller afgebroken.
  • Wat is proofreading?
    polymerases verwijderen dmv exonuclease activiteit wanneer er tijdens polymerisatie een foute base wordt ingebouwd
  • Wat bevat een PCR-reactiemix?
    -Het nucleinezuur template
    -Twee primers
    - DNA-polymerase
    -Nucleotiden (dNTPS's)
    -PCR buffer met magnesiumchloride
  • Waarom manipuleer je DNA?
    - eiwit in grote hoeveelheden produceren
    - functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken
    - effect van gen mutanten bestuderen
    - promotor activeren
    - eiwit fluorescent maken en lokalisatie volgen
  • waarom wordt cDNA gebruikt in PCR?
    Omdat DNA-polymerases gebruikt worden en er dus geen RNA vermenigvuldigd kan worden. Daarom wordt er cDNA van RNA gemaakt.
  • 5 stappen van kloneren
    1. digestie
    2. ligatie
    3. transformatie
    4. identificatie
    5. vermenigvuldigen
  • Hoe wordt cDNA gemaakt?
    m.b.v. een reverse transcriptase en één primer. Er onstaat dan een RNA-DNA hybride die tijdens de eerste denaturatiestap vd PCR gedenatureerd zal worden.
  • Wat is digestie?
    DNA ( plasmide of PCR product) met RE knippen en om plasmide te linealiseren
  • Wat zijn de regels bij het ontwerpen van primers?
    - Tussen 17-28 bp
    -Tussen 40 en 60% GC
    - Een GC aan het 3'
    - Een Tm tussen 55 en 70 C
    -Beide primers moeten dezelfde Tm hebben (max 2 C verschil)
  • Wat zijn restrictie-enzymen?
    enzymen die DNA aan specifieke sequenties ( = palindromen) binden en de suiker-fosfaatketen verbreken ( = endonuclease)
  • Hoe bereken je de Tm?
    4 X ( G + C) + 2 X (T + A)
  • Wat is een isoschizomeer?
    deze herkennen dezelfde sequentie en knippen op dezelfde plek
  • Hoe bereken je de Ta?
    Ta = Tm - 5 C
  • Wat is een neoschizomeer?
    Deze herkennen dezelfde sequentie maar knippen op een andere plek
  • Wat zijn de voordelen van qPCR?
    -Minder kans op contaminatie doordat je geen analyse meer hoeft uit te voeren.
    -Hoeveelheid product wordt gemeten, waardoor kwantificering van startmateriaal mogelijk is.
    -Meerdere PCR producten tegelijk meten in één reactie.
  • Wat is een isocaudomeer?
    Deze herkennen andere sequenties, maar geven dezelfde stikey-ends (GEEN PALINDROOM MEER!)
  • Is het voordeliger te digesteren met 1 of 2 restrictie-enzymen?
    1, omdat inserts in 2 oriëntaties geligeerd kunnen worden. Maar er is wel kans op zelf-ligerende plasmides
  • Wat is ligatie?
    DNA fragment in plasmide inbouwen
  • Welke controles neem je mee bij ligatie?
    1. plasmide digest - ligase => geen heel plasmide aanwezig
    2. plasmide digestt + ligase => geknipt met 1 RE
  • Wat zijn vectoren?
    een transportmiddel om vreemd DNA in gastheercel te brengen, bevat een origin of replication
  • Wat zijn plasmides?
    • double stranded
    • circulair
    • zelf-replicerend
    • extra-chromosomale DNA moleculen
  • Wat is het verschil tussen transformatie, transfectie en transductie?
    • transformatie: introductie van vreemd DNA in competente cellen
    • transfectie: eukaryoten met plasmide of siRNA (dit zorgt ervoor dat gen expressie omlaag reguleert!!)
    • transductie: bacteriën en eukaryote cellen met een virus
  • Hoe kun je cellen artificieel competent maken?
    1. door een chemische behandeling van bacterien met CaCl2 gevolgd door een heatshock
    2. door elektroporatie dmv een elektrische shock
  • Wat zorgt voor de blauw/witte kolonies bij blauw-wit screening en waarom is dit gebaseerd?
    • gebaseerd op de omzetting van lactose door B-galactosidase
    • WIT: als er een insert aan het lac Z gen zit, kan IPTG niet meer binden dus witte kolonies
    • BLAUW: als er geen insert aan het lacZ gen zit, bindt IPTG, wat zorgt voor blauwe kolonies
  • Waarom wil je bio-moleculen isoleren?
    - onderzoek naar RNA: expressie genen, isoformen
    - onderzoek naar eiwitten : expressie, functie, structuur of activiteit
  • Wat is het verschil tussen mRNA, rRNA en tRNA?
    • mRNA: vertaald naar eiwitten
    • rRNA: vormen ribosomen voor translatie
    • tRNA: nodig voor eiwitsynthese
  • Welke typen centrifugatie zijn er?
    1. differentiele centrifugering of pelletering: DNA/RNA precipitatie met ethanol of isopropanol
    2. dichtheidsgradiënt centrifugering: fenol extractie
  • Waarom is Nothern blot nadelig?
    1. veel RNA nodig
    2. radioactief
    3. niet sensitief
  • Wat zijn huishoudgenen?
    - cruciale genen voor de basisfuncties in de cel
  • Welke primers zijn er om cDNA te maken?
    1. poly-dT primer: cDNA pool van alle mRNA moleculen via poly-A staart
    2. random primers van 6 bp (hexameren): cDNA pool van alle RNA moleculen
    3. specifieke primers: cDNA van 1 specifiek mRNA, microRNA of LncRNA
  • Hoe meet je PCR producten tijden qPCR?
    1. Sybr.Green
    2. Taqman probes ( DNA wat in de weg staat wordt opgegeten) (2 primers en 1 probe)
    3. in een speciaal PCR apparaat met PCR reactie in een speciale plaat, zodat het signaal uitgelezen kan worden
  • Waardoor kan een referentiereeks bij PCR niet erg betrouwbaar zijn?
    - minder cellen in experiment dan in het controle sample
    - experimentele RNA sample had minder RNA om mee te beginnen
    - cDNA reactie minder efficient in experimentele sample
    - daarom altijd huishoudgenen meenemen!!
  • Waarom doe je een genetische test?
    - DNA varianten die ziektes veroorzaken
    - DNA scan voor interessante links
    - voor de geboorte erfelijke afwijkingen op te sporen
    - belangrijke methode voor genetisch onderzoek
    - commercieel verkrijgbaar
  • Wat is shotgun sequencing?
    een methode om random stukken DNA te sequencen en daarna "in elkaar te puzzelen"
  • Welke soorten next gen sequencing zijn er?
    1. first generation: lezen van 1 product
    2. next generation ( next gen) : massive parallel sequencing
    3. third generation: single molecule sequencing
  • Wat is E-value?
    de significantie die een indicatie van de kwaliteit van de match geeft bij blasten
Read the full summary
This summary. +380.000 other summaries. A unique study tool. A rehearsal system for this summary. Studycoaching with videos.

Latest added flashcards

Wanneer je een oplossing centrifugeert, welke fasen met welke componenten krijg je dan na centrifugatie?
Onderaan: organische fase; bevat organische oplosmiddelen 
Midden: interfase; vetten gemengd met eiwitten
Bovenaan: waterfase; nucleinezuren (DNA/RNA) met koolhydraten

Dus bij DNA/RNA isolatie neem je allen de waterfase mee
Wat doet DMSO bij PCR?
DMSO, formamide of glycerol verbetert processiviteit van (Taq-) DNA polymerase door de H-bruggen van DNA te destabiliseren. Hierdoor kan het enzym dsDNA ontwinden.
Wanneer gebruik je whole genome sequencing?
Bij het bepalen van al het chromosomale DNA van het organisme
Hoe werkt ion torrent?
Het is gebaseerd op waterstofionen die vrijkomen tijden de DNA polymerisatie
Waarop is Illumina gebaseerd?
Het is gebaseerd op reversibele kleur-terminators die de identificatie van enkele basen mogelijk maken wanneer ze in DNA-strengen worden geïntroduceerd.
Wat is zoutprecipitatie?
=> fractionele precipitatie

- Neerslaan eiwit door zoutconcentratie verhoging
- Ammoniumsulfaat
- Alle eiwitten reageren verschillend op verschillende zoutconcentraties
- Afdraaien; centrifugeren
- In het water opgeloste pellet/supernatant, beide hoge zoutconcentratie
- Dit is geen probleem voor gelfiltratie en HIC maar wel voor andere methoden
- Monsters uit HIC bevatten ook vaak te veel zout voor verdere chromatografie
- Ontzouten
Wat is het verschil tussen dialyse en ultrafiltratie?
Dialyse is voor het selectief moleculen verwijderen uit je oplossing.
Ultrafiltratie concentreert het eiwit.

=> Voor verwijdering van zout of kleine organische moleculen
Wat is de volgorde van Edman degradatie?
  1. Knippen van de aminozuurketen
  2. Chemische verandering van het eindstandig aminozuur met fenyl
  3. Losmaken van dit aminozuur (rest blijft intact!)
  4. Bepaling identiteit aminozuur
  5. Volgend aminozuur: identificatie van het gehele eiwit (max. 50 aminozuren)
  6. Nu: sequencing DNA, eiwit sequentie is minder belangrijk
  7. Vervolgens massa spectrometrie op eiwitten en peptiden
Waarbij kun je de Pfaffle rekenmethode toepassen?
Bij PCR;

- Bij de Pfaffle neem je altijd een referentie verdunningsreeks mee
- Daarom bereken je elke PCR opnieuw de PCR efficiency (E)

ratio = ((Etarget) x deltaCTtarget) / ((Eref) x deltaCTref)

Nadeel: minder ruimte op PCR plaat wegen referentie verdunningsreeksen
Waar dienen buffers P1, P2 en N3 voor?
Buffer P1: bacterien in de juiste startbuffer
Buffer P2: lyseert bacterien 
Buffer N3: denatureert eiwitten; scheiden plasmide DNA van eiwitten