Lees hier de samenvatting en de meest belangrijke oefenvragen van MBT

• Basisprincipes van de PCR

  Dit is een preview. Er zijn 222 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 20/10/2017
  Laat hier meer flashcards zien

• Waarop baseer je een PCR?

  DNA replicatie in een cel 
  - DNA polymerase beweegt over het DNA van 3 -> 5
  - DNA polymerase maakt nieuw DNA van 5-> 3

• Wat is het verschil tussen replicatie en PCR?

  1. RNA primers/ artificiële DNA primers (oligo's)
  2. 37C en 96C
  3. helicase bij replicatie, taq polymerase (72C) bij PCR

• Wat is het protocol van PCR?

  1. denaturatie ( = uitsmelten) 90-96C, 15-30 sec
  2. annealing (= hybridisatie primer) 50-65C, 15-30 sec
  3. extensie ( = elongatie door polymerase) 72C, 30s-5 min
  (4. DNA synthese 72C, 10 min)

• Waar bevinden alle stoffen zich bij de fenol/chloroform isolatiemethode?

  Eiwitten in de interfase, nucleinezuren en koolhydraten in de waterfase (bovenste fase), organische oplosmiddelen en vetten onderin de buis.
  Na preciptatie met isopropanol is het DNA/RNA op de bodem neergeslagen.

• Waaraan moet een primer design aan voldoen?

  • 3'end G of C
  • 17-28 bp
  • 40-60% GC
  • dimeren en interne 'self-annealing' voorkomen
  • Tm tussen 50-70C
    

• Waarom manipuleer je DNA?

  - eiwit in grote hoeveelheden produceren
  - functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken
  - effect van gen mutanten bestuderen
  - promotor activeren
  - eiwit fluorescent maken en lokalisatie volgen

• waarom wordt cDNA gebruikt in PCR?

  Omdat DNA-polymerases gebruikt worden en er dus geen RNA vermenigvuldigd kan worden. Daarom wordt er cDNA van RNA gemaakt.

• Hoe wordt cDNA gemaakt?

  m.b.v. een reverse transcriptase en één primer. Er onstaat dan een RNA-DNA hybride die tijdens de eerste denaturatiestap vd PCR gedenatureerd zal worden.

• Wat zijn de regels bij het ontwerpen van primers?

  - Tussen 17-28 bp
  -Tussen 40 en 60% GC
  - Een GC aan het 3'
  - Een Tm tussen 55 en 70 C
  -Beide primers moeten dezelfde Tm hebben (max 2 C verschil)

• Wat zijn de voordelen van qPCR?

  -Minder kans op contaminatie doordat je geen analyse meer hoeft uit te voeren.
  -Hoeveelheid product wordt gemeten, waardoor kwantificering van startmateriaal mogelijk is.
  -Meerdere PCR producten tegelijk meten in één reactie.