Summary Class notes - MBT

Course
- MBT
- Sigrid Beiboer
- 2017 - 2018
- Hogeschool Leiden (Hogeschool Leiden, Leiden)
- Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek
237 Flashcards & Notes
3 Students
  • This summary

  • +380.000 other summaries

  • A unique study tool

  • A rehearsal system for this summary

  • Studycoaching with videos

Remember faster, study better. Scientifically proven.

PREMIUM summaries are quality controlled, selected summaries prepared for you to help you achieve your study goals faster!

Summary - Class notes - MBT

  • 1508450400 Basisprincipes van de PCR

  • Wat is mRNA?
    Een kopie van het genomisch DNA en is de template bij eiwitsynthese.
  • Wat doet een PCR?
    vermeerdert (amplificeert) een specifiek stuk DNA
  • Wat is rRNA?
    Ribosomaal RNA vormt het RNA deel van het ribosoom, de eiwitsynthesemachine van de cel.
  • Waarom doe je een PCR?
    - aanwezigheid gen of andere sequentie aantonen
    - promotor, gen of andere genetische onderdelen kloneren
  • Wat is tRNA?
    Transfer RNA levert het juiste aminozuur aan het ribosoom bij de eiwitsynthese.
  • Waarop baseer je een PCR?
    DNA replicatie in een cel 
    - DNA polymerase beweegt over het DNA van 3 -> 5
    - DNA polymerase maakt nieuw DNA van 5-> 3
  • Wat is snRNA?
    Small nuclear RNA speelt een rol bij het splicen van mRNA.
  • Waarmee maak je een PCR specifieker?
    - primer PCR voor PCR ontwerp
    - primase RNA primer voor DNA replicatie
  • Wat is miRNA?
    Micro RNA's zijn korte stukken niet-coderende RNA die de eiwitsynthese blokkeren. (genexpressie)
  • Wat is het verschil tussen replicatie en PCR?
    1. RNA primers/ artificiële DNA primers (oligo's)
    2. 37C en 96C
    3. helicase bij replicatie, taq polymerase (72C) bij PCR
  • Wat bevat een lysisbuffer?
    Natrium-/Tris-zouten, EDTA (een detergens), proteasen (Lysozym/proteinase K) en nucleaseremmers.
  • Wat is het protocol van PCR?
    1. denaturatie ( = uitsmelten) 90-96C, 15-30 sec
    2. annealing (= hybridisatie primer) 50-65C, 15-30 sec
    3. extensie ( = elongatie door polymerase) 72C, 30s-5 min
    (4. DNA synthese 72C, 10 min)
  • Waar bevinden alle stoffen zich bij de fenol/chloroform isolatiemethode?
    Eiwitten in de interfase, nucleinezuren en koolhydraten in de waterfase (bovenste fase), organische oplosmiddelen en vetten onderin de buis.
    Na preciptatie met isopropanol is het DNA/RNA op de bodem neergeslagen.
  • Waaraan moet een primer design aan voldoen?
    • 3'end G of C
    • 17-28 bp
    • 40-60% GC
    • dimeren en interne 'self-annealing' voorkomen
    • Tm tussen 50-70C
  • DNA is stabieler als RNA en RNA wordt daarom ook sneller afgebroken.
  • Wat is proofreading?
    polymerases verwijderen dmv exonuclease activiteit wanneer er tijdens polymerisatie een foute base wordt ingebouwd
  • Wat bevat een PCR-reactiemix?
    -Het nucleinezuur template
    -Twee primers
    - DNA-polymerase
    -Nucleotiden (dNTPS's)
    -PCR buffer met magnesiumchloride
  • Waarom manipuleer je DNA?
    - eiwit in grote hoeveelheden produceren
    - functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken
    - effect van gen mutanten bestuderen
    - promotor activeren
    - eiwit fluorescent maken en lokalisatie volgen
  • waarom wordt cDNA gebruikt in PCR?
    Omdat DNA-polymerases gebruikt worden en er dus geen RNA vermenigvuldigd kan worden. Daarom wordt er cDNA van RNA gemaakt.
  • 5 stappen van kloneren
    1. digestie
    2. ligatie
    3. transformatie
    4. identificatie
    5. vermenigvuldigen
  • Hoe wordt cDNA gemaakt?
    m.b.v. een reverse transcriptase en één primer. Er onstaat dan een RNA-DNA hybride die tijdens de eerste denaturatiestap vd PCR gedenatureerd zal worden.
  • Wat is digestie?
    DNA ( plasmide of PCR product) met RE knippen en om plasmide te linealiseren
  • Wat zijn de regels bij het ontwerpen van primers?
    - Tussen 17-28 bp
    -Tussen 40 en 60% GC
    - Een GC aan het 3'
    - Een Tm tussen 55 en 70 C
    -Beide primers moeten dezelfde Tm hebben (max 2 C verschil)
  • Wat zijn restrictie-enzymen?
    enzymen die DNA aan specifieke sequenties ( = palindromen) binden en de suiker-fosfaatketen verbreken ( = endonuclease)
  • Hoe bereken je de Tm?
    4 X ( G + C) + 2 X (T + A)
  • Wat is een isoschizomeer?
    deze herkennen dezelfde sequentie en knippen op dezelfde plek
  • Hoe bereken je de Ta?
    Ta = Tm - 5 C
  • Wat is een neoschizomeer?
    Deze herkennen dezelfde sequentie maar knippen op een andere plek
  • Wat zijn de voordelen van qPCR?
    -Minder kans op contaminatie doordat je geen analyse meer hoeft uit te voeren.
    -Hoeveelheid product wordt gemeten, waardoor kwantificering van startmateriaal mogelijk is.
    -Meerdere PCR producten tegelijk meten in één reactie.
  • Wat is een isocaudomeer?
    Deze herkennen andere sequenties, maar geven dezelfde stikey-ends (GEEN PALINDROOM MEER!)
  • Is het voordeliger te digesteren met 1 of 2 restrictie-enzymen?
    1, omdat inserts in 2 oriëntaties geligeerd kunnen worden. Maar er is wel kans op zelf-ligerende plasmides
  • Wat is ligatie?
    DNA fragment in plasmide inbouwen
  • Welke controles neem je mee bij ligatie?
    1. plasmide digest - ligase => geen heel plasmide aanwezig
    2. plasmide digestt + ligase => geknipt met 1 RE
  • Wat zijn vectoren?
    een transportmiddel om vreemd DNA in gastheercel te brengen, bevat een origin of replication
  • Wat zijn plasmides?
    • double stranded
    • circulair
    • zelf-replicerend
    • extra-chromosomale DNA moleculen
  • Wat is het verschil tussen transformatie, transfectie en transductie?
    • transformatie: introductie van vreemd DNA in competente cellen
    • transfectie: eukaryoten met plasmide of siRNA (dit zorgt ervoor dat gen expressie omlaag reguleert!!)
    • transductie: bacteriën en eukaryote cellen met een virus
  • Hoe kun je cellen artificieel competent maken?
    1. door een chemische behandeling van bacterien met CaCl2 gevolgd door een heatshock
    2. door elektroporatie dmv een elektrische shock
  • Wat zorgt voor de blauw/witte kolonies bij blauw-wit screening en waarom is dit gebaseerd?
    • gebaseerd op de omzetting van lactose door B-galactosidase
    • WIT: als er een insert aan het lac Z gen zit, kan IPTG niet meer binden dus witte kolonies
    • BLAUW: als er geen insert aan het lacZ gen zit, bindt IPTG, wat zorgt voor blauwe kolonies
  • Waarom wil je bio-moleculen isoleren?
    - onderzoek naar RNA: expressie genen, isoformen
    - onderzoek naar eiwitten : expressie, functie, structuur of activiteit
  • Wat is het verschil tussen mRNA, rRNA en tRNA?
    • mRNA: vertaald naar eiwitten
    • rRNA: vormen ribosomen voor translatie
    • tRNA: nodig voor eiwitsynthese
  • Welke typen centrifugatie zijn er?
    1. differentiele centrifugering of pelletering: DNA/RNA precipitatie met ethanol of isopropanol
    2. dichtheidsgradiënt centrifugering: fenol extractie
  • Waarom is Nothern blot nadelig?
    1. veel RNA nodig
    2. radioactief
    3. niet sensitief
  • Wat zijn huishoudgenen?
    - cruciale genen voor de basisfuncties in de cel
  • Welke primers zijn er om cDNA te maken?
    1. poly-dT primer: cDNA pool van alle mRNA moleculen via poly-A staart
    2. random primers van 6 bp (hexameren): cDNA pool van alle RNA moleculen
    3. specifieke primers: cDNA van 1 specifiek mRNA, microRNA of LncRNA
  • Hoe meet je PCR producten tijden qPCR?
    1. Sybr.Green
    2. Taqman probes ( DNA wat in de weg staat wordt opgegeten) (2 primers en 1 probe)
    3. in een speciaal PCR apparaat met PCR reactie in een speciale plaat, zodat het signaal uitgelezen kan worden
  • Waardoor kan een referentiereeks bij PCR niet erg betrouwbaar zijn?
    - minder cellen in experiment dan in het controle sample
    - experimentele RNA sample had minder RNA om mee te beginnen
    - cDNA reactie minder efficient in experimentele sample
    - daarom altijd huishoudgenen meenemen!!
  • Waarom doe je een genetische test?
    - DNA varianten die ziektes veroorzaken
    - DNA scan voor interessante links
    - voor de geboorte erfelijke afwijkingen op te sporen
    - belangrijke methode voor genetisch onderzoek
    - commercieel verkrijgbaar
  • Wat is shotgun sequencing?
    een methode om random stukken DNA te sequencen en daarna "in elkaar te puzzelen"
  • Welke soorten next gen sequencing zijn er?
    1. first generation: lezen van 1 product
    2. next generation ( next gen) : massive parallel sequencing
    3. third generation: single molecule sequencing
  • Wat is E-value?
    de significantie die een indicatie van de kwaliteit van de match geeft bij blasten
Read the full summary
This summary. +380.000 other summaries. A unique study tool. A rehearsal system for this summary. Studycoaching with videos.