Samenvatting Class notes - Biomethoden

Vak
- Biomethoden
- VRTI
- 2017 - 2018
- Hanzehogeschool Groningen (Hanzehogeschool Groningen, Groningen)
- Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek
156 Flashcards en notities
6 Studenten
  • Deze samenvatting

  • +380.000 andere samenvattingen

  • Een unieke studietool

  • Een oefentool voor deze samenvatting

  • Studiecoaching met filmpjes

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Samenvatting - Class notes - Biomethoden

  • 1511478000 Les 1-3 - Minimal Residual Disease (MRD)

  • Wat betekent RNA?
    Ribonucleic acid (Nederlands: ribonucleïnezuur)
  • Hoe ziet een RNA-monomeer eruit?
    Als een nucleotide bestaande uit een fosfaatgroep, een pentosesuiker en een stikstofbase.
    - Pentosesuiker bij RNA = ribose (met een 2'-OH groep)
    - Stikstofbase bij RNA = adenine (A), cytosine (C), guanine (G) of uracil (U)
  • Wat is het verschil tussen RNA en DNA?
    RNA:
    - Enkelstrengs
    - Ribose als pentosesuiker (met een 2'-OH groep)
    - Uracil (U) als stikstofbase  

    DNA:
    - Dubbelstrengs
    - Deoxyribose als pentosesuiker (met een 2' H-groep)
    - Thymine (T) als stikstofbase
  • Welke 3 soorten RNA zijn er?
    - Messenger RNA (mRNA)
    - Ribosomaal RNA (rRNA)
    - Transfer RNA (tRNA)
  • Hoe wordt messenger RNA (mRNA) gevormd?
    DNA wordt tijdens de transcriptie omgezet in pre-mRNA. Hierbij wordt de pre-mRNA streng complementair aan de non-sense DNA streng gevormd, zodat het mRNA sense is en de genetische code bevat. Daarna volgen post-trancriptionele processen om het pre-mRNA om te zetten in mRNA.
  • Welke drie post-transcriptionele processen zijn er?
    - Toevoegen van een 5' cap (gemodificeerde guanine)
    - Toevoegen van een 3' polyA-staart (heel veel adenines)
    - Splicing
  • Wat is de functie van de 5' cap als onderdeel van het mRNA?
    De 5' cap maakt het mRNA stabiel en beschermt het mRNA hierdoor tegen afbraak. Daarnaast is het een herkenningspunt voor het enzym voor de translatie.
  • Wat is de functie van de 3' polyA-staart als onderdeel van het mRNA?
    De 3' polyA-staart maakt het mRNA stabiel en beschermt het mRNA hierdoor tegen afbraak.
  • Wat is de functie van splicing als post-transcriptioneel proces?
    Bij splicing worden de intronen eruit gehaald en worden de exonen aan elkaar gehecht, zodat het mRNA alleen uit exonen bestaat.
  • Wat is het verschil tussen exonen en intronen?
    Intronen coderen niet voor eiwitten, terwijl exonen wel coderen voor eiwitten.
  • Wat is de functie van messenger RNA (mRNA)?
    Het mRNA is een boodschapper van het genetisch materiaal en brengt een kopie van het genetisch materiaal vanuit de celkern naar de ribosomen, zodat het genetisch materiaal kan worden omgezet in eiwitten.
  • Wat is de functie van ribosomaal RNA (rRNA)?
    Het rRNA is onderdeel van de ribosomen.
  • Wat is de functie van transfer RNA (tRNA)?
    Het tRNA speelt een functie bij de translatie van het mRNA doordat het tRNA met een specifiek gebonden aminozuur (overeenkomend met het anticodon van het tRNA) kan binden op de A-site van het ribosoom, doordat het anticodon complementair is aan een codon op het mRNA.
  • Waarom isoleer je RNA?
    mRNA bevat alleen exonen en geen intronen, doordat deze eruit gehaald zijn tijdens de splicing. Daardoor geeft RNA informatie over de genexpressie, terwijl DNA dit niet geeft (DNA bevat zowel exonen als intronen).
  • Wat doet RNAse?
    RNAse is een enzym dat zich op de handen bevindt en RNA kan afbreken. Daarom moet bij het isoleren van RNA RNAse vrij gewerkt worden. Dit kan worden bereikt door handschoenen te dragen.
    - Let op! RNAses raak je niet kwijt met autoclaveren, dus pipetpuntbakjes moeten ook gevuld worden met handschoenen aan.
  • Geef een flowchart weer van de MRD proef.
    Dag 1:
    - K562 cellen en Jurkat cellen in kweek tellen m.b.v. Bürker telkamer.
    - IJklijn pipetteren met 0-100% K562 cellen.
    - RNA isolatie m.b.v. TRIzol Reagent.
    - Concentratie en zuiverheid van het geïsoleerde RNA bepalen m.b.v. Nanodrop.
    - Kwaliteit/integriteit van het geïsoleerde RNA bepalen m.b.v. agarose gelelektroforese.

    Dag 2:  
    - cDNA synthese m.b.v. M-MLV RT door middel van RT-PCR.
    - Real-time PCR met SYBR green en primers tegen BCR-ABl en GAPDH.
    - Uitwerken met de Pfaffl methode.
  • Wat is het doel van de MRD proef?
    Het doel van het experiment is om het aantal K562 cellen (tumorcellen) met de BCR-ABl translocatie in een onbekend monster te bepalen met behulp van real-time RT PCR en de Pfaffl methode, door de genexpressie van het BCR-ABl gen te vergelijken met de genexpressie van het GAPDH gen.
  • Wat betekent de afkorting MRD?
    Minimal Residual Disease
  • Wat is minimal residual disease (MRD)?
    De minimal residual disease is het minimale aantal tumorcellen dat nodig is om een relapse te krijgen, waarbij de ziekte terugkeert. Met behulp van moleculaire technieken als PCR kan al een zeer klein aantal tumorcellen worden bepaald, zelfs bij volledige remissie, wanneer er geen symptomen aanwezig zijn. Dit is o.a. van belang voor patiënten na een tumorbehandeling om te kijken of de behandeling goed heeft aangeslagen.
  • Hoe ontstaat de BCR-ABl translocatie?
    Bij de BCR-ABl translocatie verplaatst het ABl proto-oncogen van chromosoom 9 naar chromosoom 22, waar het gen aan het BCR-gen wordt gefuseerd. Hierdoor ontstaat het BCR-ABl oncogen op het nieuw gevormde Philadelphia chromosoom. Dit chromosoom met de BCR-ABl translocatie wordt vaak gevonden in patiënten met chronische myeloïde leukemie (CML).
  • Welke cellen gebruik je tijdens de MRD proef?
    - K562 cellen, geïsoleerd uit een patiënt met CML, met de BCR-ABl translocatie.
    - Jurkat cellen zonder de BCR-ABl translocatie ('normale' cellen).
  • Hoe wordt de ijklijn met 0-100% K562 cellen bereid?
    Er wordt een celconcentratiereeks gepipetteerd met 0-100% K562 cellen, waar nodig aangevuld met Jurkat cellen, zodat elk monster een totaal aantal cellen van 2 miljoen bevat.
  • Hoe werkt het cellen tellen met de Bürker telkamer?
    Om te bepalen welk volume van elke kweek aan elk monster van de celconcentratiereeks moet worden toegevoegd moet het aantal cellen in beide kweken worden geteld. Hiertoe worden eerst de cellen verdund met Trypaanblauw.
    - Trypaanblauw kan niet door het intacte celmembraan van cellen heendringen, waardoor levende cellen ongekleurd blijven.
    - Trypaanblauw kan wel door het celmembraan van dode cellen heen, waardoor dode cellen blauw kleuren.
    Onder de microscoop kan vervolgens het aantal levende cellen in de verdunde celkweken worden bepaald door het aantal cellen in een vastgesteld volume te tellen. Tenslotte kan hieruit het aantal cellen in de onverdunde kweken worden bepaald.
  • Hoe ga je RNA isoleren tijdens de MRD proef?
    Met TRIzol Reagent, bestaande uit fenol en guanidine isothyocyanate.
    - De combinatie van fenol en guanidine isothyocyanate zorgt voor cel lysis, zodat de cellen kapot gaan en de celinhoud vrijkomt.
    - Guanidine isothyocyanate is een RNAse remmer, waardoor het vrijgekomen RNA wordt beschermd tegen afbraak door RNAse. 
    - Let op! Het is belangrijk dat het TRIzol Reagent een lage pH heeft om ervoor te zorgen dat het RNA in de waterige fase terechtkomt (bij neutrale en hoge pH komt DNA in waterige fase).

    Daarna volgt toevoeging van chloroform.
    - Door toevoeging van chloroform ontstaat er fasescheiding: onderin een rood/roze organische fenol/chloroform fase met eiwitten en vetten; een interfase met DNA; bovenin een waterige fase met RNA (en guanidine isothyocyanate).

    Vervolgens, na isolatie van de waterige fase met RNA, volgt toevoeging van isopropanol.
    - Door toevoeging van isopropanol ontstaat er RNA precipitatie: na centrifugatie wordt het RNA geprecipiteerd uit de waterige fase, waardoor zich een RNA pellet vormt.

    RNA wassen met 75% ethanol om de restanten van de organische oplosmiddelen te verwijderen. Daarna RNA pellet laten drogen.
    - Let op! Pellet niet compleet laten drogen, want dan verliest de pellet oplosbaarheid en wordt bij de nanodrop een A260/280 onder de 1,6 gemeten.

    RNA resuspensie: RNA pellet wordt opgelost in DEPC water en verwarmd bij 55-60 graden in een heatblock.
  • Wat is het principe van de Nanodrop?
    De Nanodrop is een spectrofotometer in het ultraviolet (UV) gebied (180-380 nm) en bestaat uit een lichtbron, monochromator (selectie van golflengte), sample, lichtdetector en een computer om het resultaat weer te geven. Het principe berust op de wet van Lambert-beer (A = E * c * l). Hierbij zijn E en l vaste waarden zijn, zodat de concentratie in het sample in direct verband staat met de gemeten absorptie. Hierbij geldt: hoe hoger de gemeten absorptie, hoe hoger de concentratie in het sample.
  • Wat wordt er door de Nanodrop gemeten bij de verschillende golflengtes (230, 260, 280 en 340 nm)?
    230 nm = concentratie organische stoffen
    260 nm = concentratie nucleïnezuren (concentratie RNA, DNA en vrije nucleotiden)
    280 nm = concentratie eiwitten
    340 nm = achtergrondruis (baseline)
  • Wat vertelt de A260/280 ratio?
    De A260/280 ratio geeft de verhouding weer tussen de gemeten absorptie bij 260 nm (RNA/DNA) en 280 nm (eiwitten) en zegt daarmee iets over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA/DNA door de contaminatie met eiwitten vast te stellen. Een waarde tussen de 1,8-2,2 is goed. Een waarde onder de 1,8 duidt op contaminatie met eiwitten.
  • Waardoor wordt de A260/280 ratio beïnvloedt?
    Door de pH: een hogere pH leidt tot een lagere eiwitconcentratie door denaturatie van de eiwitten, waardoor de A280 lager wordt. De concentratie bij 260 nm blijft gelijk, waardoor de A260/280 ratio hoger wordt bij een hogere pH.
  • Hoe wordt de agarose gel en de monsters bereid voor de agarose gelelektroforese?
    Bij de analyse van RNA wordt een semi-gedenatureerde 0,8% agarose gel gebruikt, omdat bij RNA bij een semi-gedenatureerde gel scherpere bandjes worden verkrijgen, waardoor minder twijfel ontstaat tussen smeervorming of niet.
    - Guanidine thiocyanate (GTH) wordt toegevoegd om het semi-gedenatureerde karakter te verkrijgen. GTH denatureert eiwitten en is een RNAse remmer. 

    De monsters worden gemengd met formamide voor deze op gel te brengen.
    - Formamide stabiliseert het RNA in oplossing.
  • Wat zegt het resultaat van de agarose gelelektroforese over de kwaliteit/integriteit van het geïsoleerde RNA?
    Het geïsoleerde RNA bestaat uit zowel mRNA, rRNA als tRNA, waarbij het rRNA ongeveer 85% omvat. Intact RNA zal hierdoor bandjes moeten opleveren bij 28S en 18S rRNA als onderdeel van respectievelijk de grote en kleine subunit van eukaryote ribosomen. Bij RNA van goede kwaliteit hoort hierbij de intensiteit van de 28S band ongeveer 2x zo sterk te zijn als die van de 18S band. Gedegradeerd RNA, door afbraak door RNAse, leidt tot smeervorming. Gedeeltelijk gedegradeerd RNA zal leiden tot zowel smeervorming als zichtbare bandjes. Wanneer er contaminatie is met genomic DNA (gDNA) zal nog een extra bandje zichtbaar zijn aan de bovenkant van de gel. Oplossing hiervoor kan zijn om een extra DNAse stap uit te voeren.
  • Welke 3 soorten primers kunnen er worden gebruikt tijdens de cDNA synthese?
    - Gen-specifieke primers: alleen het specifieke gen op het mRNA wordt omgezet in cDNA, waarna al het gesynthetiseerde cDNA wordt geamplificeerd (eenstaps cDNA synthese: combinatie van cDNA synthese en qPCR).

    - Oligo(dT) primers: de primers binden specifiek aan de polyA-staart van mRNA tijdens de cDNA synthese. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese).

    - Random hexameren: de primers binden random, dus niet-specifiek, op verschillende plekken op het mRNA. Daarna wordt slechts ~10% van het gesynthetiseerde cDNA geamplificeerd tijdens de qPCR (tweestaps cDNA synthese).
  • Wat zijn de voor- en nadelen van een eenstaps cDNA synthese tegen een tweestaps cDNA synthese?
    De voordelen van een eenstaps cDNA synthese zijn dat er minder pipetteerstappen zijn en dat er daardoor minder kans is op het maken van fouten of contaminatie.

    De nadelen van een eenstaps cDNA synthese zijn dat er een compromis buffer nodig is waarin beide polymerases (RT tijdens cDNA synthese en Taq tijdens qPCR) goed kunnen functioneren, maar hierin kunnen niet beide optimaal functioneren. Daarnaast is er meer kans op primer-dimer vorming en blijft er geen cDNA over voor andere analysis.  

    De voordelen van een tweestaps cDNA synthese zijn dus dat er twee verschillende buffers kunnen worden meegenomen, waarin beide polymerases optimaal kunnen functioneren en dat er cDNA overblijft voor andere analysis.

    De nadelen van een tweestaps cDNA synthese zijn dus dat er meer pipetteerstappen nodig zijn en dat er daardoor meer kans is op het maken van fouten of contaminatie.
  • Waarom vindt er cDNA synthese plaats en welke benodigdheden zijn er?
    Bij de cDNA synthese wordt het geïsoleerde RNA omgezet in cDNA (complementair- of copy-DNA, dus zonder intronen), omdat het SYBR green dat gebruikt wordt bij de qPCR alleen kan binden aan dubbelstrengs DNA.

    De benodigdheden zijn:
    - Oligo(dT)primers: binden specifiek aan de polyA-staart van het mRNA.
    - DEPC-milliQ water: om het geïsoleerde RNA in op te lossen. Het water moet DEPC (diethyl pyrocarbonate) behandeld zijn om de RNAses in het water te inactiveren.
    - dNTPs: losse nucleotiden om aan de primers te hechten tijdens de cDNA synthese.
    - 5x first strand buffer: met Tris-HCl buffer (pH 8,3), KCl en magnesiumchloride (MgCl2).
    - RNAseOUT: RNAse remmer
    - DTT (dithiothreitol): reductant
    - M-MLV RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase): enzym dat vanaf de primers losse nucleotiden kan aanhechten om cDNA te synthetiseren.
  • Wat is de functie van DTT en wat betekent de afkorting?
    DTT = dithiothreitol
    DTT is een reductant en kan hierdoor zwavelverbindingen verkregen zodat het mRNA zijn secundaire structuur verliest en lineair wordt. Dan kan het enzym reverse transcriptase er beter bij.
  • Wat is de functie van magnesiumchloride in de first strand buffer?
    Magnesiumchloride is een co-factor voor alle DNA polymerases, dus ook voor Taq polymerase en reverse transcriptase.
  • Wat zijn de kenmerken van RNAseOUT?
    RNAseOUT is een RNAse remmer en remt de afbraak van het mRNA door RNAses tijdens de cDNA synthese.
    - Het is een zuur eiwit, dus mag er geen verandering optreden in temperatuur of pH, want anders denaturatie).
    - Non-competitieve remmer voor pancreatic ribonucleases, effectief tegen RNAse A, B, C.
  • Wat zijn de kenmerken van M-MLV RT en SuperScript III Reverse transcriptase?
    M-MLV RT = Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Het is een retrovirus dat in muizen leukemie veroorzaakt en thermostabieler is dan normaal reverse transcriptase en is ontdekt door Moloney.

    SuperScript III Reverse transcriptase is M-MLV RT met een:
    - Verminderde RNAseH activiteit
    - Verhoogde thermostabiliteit: waardoor ook succesvolle cDNA synthese van GC-rijke regio's kan plaatsvinden.
  • Wat is de functie van RNAseH?
    RNAseH is het enzym dat ervoor zorgt dat het de streng mRNA van de tijdens de cDNA synthese gevormde RNA-DNA hybride wordt verwijderd.
  • Waar hangt de efficiëntie van de cDNA synthese vanaf?
    - De kwaliteit van het geïsoleerde RNA: hoe meer het geïsoleerde RNA gedegradeerd is, hoe minder cDNA er gesynthetiseerd zal worden.
    - GC-gehalte van het geïsoleerde RNA: hoe hoger het GC-gehalte hoe minder cDNA er gesynthetiseerd zal worden, omdat RT moeilijker GC-nucleotiden kan aanhechten omdat daar een sterkere binding voor nodig is (3 waterstofbruggen i.p.v. 2 waterstofbruggen bij AT).
    - Contaminatie met organisch oplosmiddel: als tijdens de RNA isolatie het geïsoleerde RNA niet goed wordt gewassen zal er tijdens de cDNA syntese minder cDNA worden gesynthetiseerd, want organische oplosmiddelen belemmeren het enzym RT.
  • Wat is het verschil tussen de normale PCR (endpoint PCR) en real-time PCR (qPCR)?
    Bij PCR worden specifieke genen op het DNA  gedurende een aantal cycli geamplificeerd, afhankelijk van de gebruikte forward en reverse primers.
    - Bij de normale PCR vindt de detectie en semi-kwantificatie pas plaats na de laatste cyclus. Voor de analyse zijn nog andere post-PCR analyses als elektroforese nodig. Daarom wordt endpoint PCR tegenwoordig vaak alleen nog gebruikt voor amplificatie van het DNA voor DNA sequencing.
    - Bij de real-time PCR wordt de hoeveelheid DNA real-time per cyclus gemeten door de uitzending van een fluorescente stof. Hierdoor kan ook tijdens de PCR gevolgd worden of de PCR goed verloopt en is er geen post-PCR analyse nodig. Alles gebeurt in één vaatje. Het is een kwantitatieve methode.
  • Hoe vindt de qPCR plaats bij de MRD proef?
    Met SYBR green als fluorescente stof en twee mastermixen met alle componenten zonder het cDNA: SYBR green supermix met Taq polymerase, magnesiumchloride, dNTPs en de fluorescente stof SYBR green, millipore water en de bijbehorende primers:
    - 1 mastermix met primers tegen het BCR-ABl gen.
    - 1 mastermix met primers tegen het GAPDH gen.
  • Wat is het GAPDH gen?
    Het GAPDH gen (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) is een huishuid gen dat codeert voor eiwitten die essentieel zijn voor normale celfuncties. Het komt in elke cel in dezelfde mate tot expressie. Het GAPDH gen is hierdoor in de K562 cellen en de Jurkat cellen in dezelfde mate aanwezig, terwijl het BCR-ABl gen alleen in de K562 cellen aanwezig is.
  • Wat zijn de kenmerken van Taq polymerase?
    Taq polymerase is een thermostabiele DNA polymerase.
    Het nadeel van Taq polymerase is dat het ook een beetje actief is bij lage temperaturen. Tijdens het opstarten van de PCR kunnen primers niet-specifiek binden, als het Taq polymerase dan al functioneert dan kunnen er aspecifieke producten ontstaan. Dit kan worden tegengegaan door een 'hotstart' PCR te doen. Een hot-start zorgt ervoor dat Taq polymerase niet actief is tijdens het opstarten van de PCR en tijdens de eerste denaturatie stap.
  • Welke 3 stappen kent de real-time PCR?
    - Denaturatie: verhitten tot ~95 graden, waardoor het dubbelstrengs DNA enkelstrengs wordt.
    - Annealing: temperatuur verlagen tot 40-60 graden, zodat de primers kunnen binden aan het enkelstrengs DNA. De annealing temperatuur is afhankelijk van de gebruikte primers doordat elke primer een andere smelttemperatuur (Tm) heeft. Vaak wordt uitgegaan van 5 graden onder de Tm van de primer.
    - Elongatie: temperatuur verhogen tot 72 graden, zodat Taq polymerase optimaal kan werken en aan de 3' kant van de primers dNTPs kan aanhechten voor amplificatie.
    Deze drie stappen vormen 1 cyclus; tijdens de real-time PCR worden doorgaans 35-40 cycli doorlopen. De ontstane amplificatieproducten hebben de lengte tussen de gebruikte primers, in dit geval dus het BCR-ABl gen of het GAPDH gen, afhankelijk van de gebruikte mastermix.

    Let op! Bij een kort amplicon worden de annealing en elongatie stap vaak gecombineerd uitgevoerd bij ~60 graden.
  • Hoe wordt de fluorescentie gemeten tijdens de real-time PCR?
    Tijdens elke cyclus neemt de hoeveelheid amplificatieproduct toe als het gen aanwezig is om het cDNA. De fluorescente stof SYBR green bindt niet-specifiek aan elk stukje dubbelstrengs DNA en neemt dus toe als de hoeveelheid amplificatieproduct toeneemt. De fluorescentie wordt continu gemeten door het qPCR apparaat en wordt uitgedrukt in relative fluorescent units (RFU).
  • Wat is de baseline bij de real-time PCR?
    De baseline is het achtergrondsignaal (ruis); het fluorescente signaal gemeten over de eerste paar cycli (doorgaans cycli 3-15), waarbij nog geen hoeveelheid DNA wordt gemeten.
  • Wat is de threshold bij de real-time PCR?
    De threshold is de detectiegrens; wordt bepaald door het qPCR apparaat, meestal de waarde waarbij het fluorescente signaal 10x de standaarddeviatie over het gemiddelde van de ruis (baseline) is.
  • Wat is de threshold cycle (Ct-waarde) bij de real-time PCR?
    De Ct-waarde is de eerste cyclus waarbij het verkregen fluorescente signaal boven de detectiegrens (threshold) uitkomt. De Ct-waarde hangt af van de concentratie DNA in het monster. Hoe hoger de concentratie DNA, hoe hoger het fluorescente signaal, waardoor het signaal eerder boven de detectiegrens zal uitkomen. Hierdoor wordt bij een hogere DNA concentratie een lagere Ct-waarde gemeten.
  • Wat is de standaard curve bij de real-time PCR?
    De standaard curve (ijlijn) is een 10-voudige verdunningsreeks (steeds 10x minder DNA in het monster) om uiteindelijk de onbekende samples te kunnen kwantificeren en voor bepaling van de primerefficiënties. Het is een grafiek waarbij de gemeten Ct-waarden worden uitgezet tegen het logaritme van de hoeveelheid cellen in het monster. Bij een standaardcurve liggen de Ct-waarden ~3,3 cycli uit elkaar.
  • Wat is de correlatie coëfficiënt bij de real-time PCR?
    De correlatie coëfficiënt is de R2 van de standaard curve (idealiter boven de 0,99) en zegt iets over hoe lineair de standaard curve door de data loopt.
Lees volledige samenvatting
Deze samenvatting. +380.000 andere samenvattingen. Een unieke studietool. Een oefentool voor deze samenvatting. Studiecoaching met filmpjes.

Laatst toegevoegde flashcards

Hoe vindt de qPCR plaats bij de MRD proef?
Met SYBR green als fluorescente stof en twee mastermixen met alle componenten zonder het cDNA: SYBR green supermix met Taq polymerase, magnesiumchloride, dNTPs en de fluorescente stof SYBR green, millipore water en de bijbehorende primers:
- 1 mastermix met primers tegen het BCR-ABl gen.
- 1 mastermix met primers tegen het GAPDH gen.
Wat zijn de kenmerken van capillair iso-elektric focussing (CIEF)?
- In het capillair wordt een buffer met een pH gradiënt aangebracht.
- Scheiding vindt plaats op basis van het iso-elektrisch punt (pH waarbij het deeltje het liefst aanwezig is): elk deeltje zoekt zijn ideale pH op in de buffer; daarna volgt de EOF, zodat de deeltjes in volgorde van de verkregen gradiënt aankomen bij de detector.
- Wordt gebruikt voor de analyse van eiwitten die veel op elkaar lijken (iso-vormen), maar een ander iso-elektrisch punt hebben (deeltjes met een hoog IEF eerst).
Wat zijn de kenmerken van micellair elektrokinetische chromatografie (MEKC)?
- In het capillair vormen zich micellen in de buffer (bolletjes: ongeladen aan binnenkant en geladen aan buitenkant).
- Lijkt op HPLC.
- Scheiding vindt plaats op basis van de affiniteit van de deeltjes voor de buffer (mobiele fase) en de micellen (stationaire fase).
- De micellen bewegen langzamer naar de detector dan de buffer, dus de deeltjes die veel affiniteit hebben voor de micellen zullen later aankomen bij de detector.
- Wordt gebruikt voor de analyse van kleine moleculen, voedingstoevoegingen of bepaalde geneesmiddelen.
Wat zijn de kenmerken van capillair gel elektroforese (CGE)?
- In het capillair wordt een gelmatrix gebracht: gel in capillair.
- Scheiding vindt plaats op basis van grootte (erg vergelijkbaar met SDS-PAGE, maar dan in een capillair).
- Hierbij wil je een lage of helemaal geen EOF hebben.
- Wordt gebruikt voor de analyse van DNA.
- Ogston sieving voor de scheiding van kleine DNA fragmenten of reptation voor de scheiding van grote DNA fragmenten (fragmenten moeten eerst van vorm veranderen voordat ze goed door de gel kunnen migreren).
Wat zijn de kenmerken van capillair free-zone elektroforese (CZE)?
- Simpele capillair elektroforese met buffer in capillair: met dezelfde buffer in het capillair als in de buffersystemen als in het sample.
- Scheiding vindt plaats op basis van de EOF.
- Wordt gebruikt voor de analyse van kleine ionen en eiwitten.
Welke 4 verschillende soorten capillair elektroforese zijn er?
- Capillair free-zone elektroforese (CZE)
- Capillair gel elektroforese (CGE)
- Micellair elektrokinetische chromatografie (MEKC)
- Capillair iso-elektric focussing (CIEF)
Hoe kan de EOF gemanipuleerd worden wanneer deze veel te sterk is en er geen goede scheiding van de deeltjes meer kan plaatsvinden?
- Elektrisch veld veranderen: een minder sterk elektrisch veld zorgt voor een verminderde EOF.
- pH van de buffer veranderen: door een lagere pH raken de silica geprotoneerd en is er een verminderde EOF.
- Ionkracht van de buffer veranderen: een lagere ionkracht zorgt voor een minder samengeperste dubbellaag en daardoor een verminderde EOF.
- Temperatuur veranderen: beïnvloedt de viscociteit van de buffer.
- Modificatie aan het capillair zelf: bij een grotere diameter is de bulk flow vaak te klein en is er geen goede EOF. 
- Elektrolyten toevoegen: meer kationen toevoegen zorgt voor een verminderde EOF door interactie met de negatieve silica aan de wand van het capillair.
- Neutrale hydrofiele polymeren toevoegen: deze schermen de negatieve silica in het capillair af, waardoor er helemaal geen EOF kan worden gecreëerd. Dit wil je wanneer er DNA wordt geanalyseerd (dan wil je helemaal geen EOF).
Waardoor worden bij capillair elektroforese de geladen deeltjes naar één pool getrokken?
Bij capillair elektroforese is er een elektro-osmotische flow (EOF): een bulk flow van vloeistof met zowel positief geladen, neutrale als negatief geladen deeltjes, welke allemaal naar de kathode (- pool) gaan, doordat de elektro-osmotische flow groter is dan de elektroforetische mobiliteit.
Hoe kunnen de eiwitten na de eiwitelektroforese zichtbaar worden gemaakt?
- Alle eiwitten kunnen worden gekleurd met Coomassie Blue (bindt niet-covalent aan alle eiwitten). Hierbij geldt: hoe intenser de blauwe kleur, hoe meer eiwit, maar deze methode is niet echt kwantificeerbaar.
- Om specifiek naar één eiwit te kijken moeten de eiwitten na de gelelektroforese op een membraan worden geblot, waarna antilichamen worden toegevoegd specifiek tegen het eiwit dat je wilt aantonen.
Wat is de elektroforetische mobiliteit?
De elektroforetische mobiliteit is afhankelijk van de snelheid (cm/s) van het deeltje en de kracht van het elektrisch veld (V/cm).

mu = V / E

Elk deeltje heeft een eigen elektroforetische mobiliteit: grotere deeltjes gaan langzamer door de gel en hebben daardoor een kleinere elektroforetische mobiliteit. Dit komt doordat er twee krachten werken op het bewegende deeltje:
- F.el = bewegingskracht / elektrische kracht (= lading * potentiaalverschil)
- F.fric = wrijvingskracht (tegengesteld aan bewegingsrichting)